辣根过氧化酶使试剂中的发光物（Luminol)氧化并发光,而试剂中含有增强剂这使得发光增强了 1000 倍。在免疫印迹中, 将复杂的蛋白混合物经

SIS-PAGE 分离,并转移到固相膜上(如NC. PVDF)等,用于免疫学检测，,经HP 标记的抗体与膜上的蛋白直接(标记一抗)或间接(标记二抗)反应.当加入

免疫印迹化学发光试剂后, Luminol 发生氧化降解,并发射波长为 428nm 的光,此光可经 X光胶片（放射自显影片),感光记录下来. 本试剂是非放射性发光系统,

用于检测固定在膜上的蛋白,其敏感性达 1-5pg.用 光片可快速地获得永久的硬拷贝结果,所含独特的底物足以推持 12 小时以上的发光,便于反复曝

光操作,免疫印迹经抗体脱卸 处理后可供再次抗体探查使用。适用于痕量蛋白或核酸检测。特别节省抗体(一抗 1:500-1:5000二抗 1:3000-1:10000)。

1.操作步骤

根据常规操作转印结束后，进行封闭、一抗孵育、二抗孵育以及必要的洗膜步骤，根据膜的大小，按每10 cm2 膜使用1-2 mL工作液，按比例吸

取等体积溶液I和溶液II混匀，配制成发光检测工作液。用平头镊子将膜取出，膜的下缘轻轻接触吸水纸，去除膜上多余的液体。用移液器将工

作液加到转印膜上，使其均匀覆盖，室温孵育1-2 min，此步骤可在洁净保鲜膜上或塑料盒中完成。

2.1 X光胶片法

1)用平头镊子夹起转印膜，膜的下缘轻轻接触吸水纸，去除膜上多余的液体，留下少量工作液，不要让膜完全干燥。膜的蛋白面朝上，包裹于

洁净保鲜膜内。轻轻赶出其间的气泡，用小块透明胶带粘住四角，固定在X光片暗盒内。

2)在暗室中取一张X光胶片置于包裹的膜上，合上暗盒，曝光30 s至1 min。立即定影、显影，根据信号的强弱适当调整曝光时间.一般为lmin 或

5min,也可选择不同时间多次压片,以达最佳效果。如果背景过高，可以使用两张X光胶片同时压片。

3)膜的重复使用

配置 62.5mM Tris-Hcl, PH6.7，2%SDS，7ml/100ml 的巯基乙醇的溶液,膜放入后，70℃振落水浴 30 分钟。再用TBST 或 PEST 缓冲液洗脱,最后用脱

脂牛奶封闭.

2.2 荧光拍照法

1) 如果需要使用CCD拍照，可以将膜放置于工作液中，开机后按照使用说明，将转印膜取出，进行拍照。

2）可以根据背景情况，调整机器测量参数，提高信噪比。

2.3 管式化学发光法

1)将鲁米诺的化学发光检测波长可设定在425 nm左右，可以选择单点测量，或者取多次平均值。

2)按照机器要求，将配制好的工作液加入到样品管中，间隔一定时间测量发光强度，注意鲁米诺系统的发光到达峰值有一定延迟（30-300 s），

不同样本的测量时间间隔要固定。

3)HRP催化鲁米诺发光的体系还受到反应温度以及pH的强烈影响，所以工作试剂准备以及发光测量需要考虑到此类因素。

3. 注意事项

1）试剂盒Solution I为底物，保存于避光试剂瓶中，Solution II为氧化剂。通常取样顺序是先取底物Solution I, 换枪头后再取氧化剂Solution II。

2）本试剂盒较为稳定，室温（25℃）可以保存两周以上，长期不用建议保存在2 -8℃。

3）使用生物素-亲和素系统时，避免使用牛奶封闭，可能会造成背景过高。

4）金属氧化物颗粒可能会造成膜上出现颗粒状斑点，避免使用带有锈迹的剪刀以及镊子，可以使用平头塑料镊子。

5）叠氮化钠抑制HRP的催化能力，在缓冲液中尽量避免使用叠氮化钠作为防腐剂。

6）封闭、洗膜、孵育等步骤耗时较长，注意膜与塑料界面的摩擦不均匀可能造成部分位置条带消失，可以在保鲜膜中孵育以及封闭，洗膜的塑

料盒底面不要有明显凸起，可以通过剪角的方法，区别转印膜有蛋白的一面。

7）不同转印膜对蛋白的吸附能力不同，硝酸纤维素较软，避免出现折痕。PVDF膜使用前需要使用甲醇水化均匀。

8）勿将多张膜置于同一个洗膜盒中洗膜，相互吸附以及摩擦可能造成很深的背景。

9）转印、封闭、孵育都要避免气泡。