1. 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)： a. 蛋白样品的准备： (a) 对于10厘米细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS洗涤一次，然后加入500微升至2毫升细胞裂解液裂解细胞。可以使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或各种RIPA裂解液等进行细胞的裂解。 (b) 对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。 (c) 对于悬浮细胞，离心收集细胞后，PBS洗涤一次，然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。 注：详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法。对于不同的培养器材，参考10厘米培养皿的裂解液的用量进行裂解。如果裂解获得的蛋白样品浓度过高，可以用裂解液或PBS适当稀释，如果蛋白样品浓度过低，在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量。 b. 去除非特异性结合(可选做)： (a) 取200微升至1毫升蛋白样品，蛋白量约为200微克至1毫克，加入约1微克和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG和20微升充分重悬的Protein A+G Agarose，4ºC缓慢摇动30分钟至2小时。 (b) 2500rpm(约1000g)离心5分钟，取上清用于后续的免疫沉淀。 注：所谓种属相同的IgG是指，例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG，则在本步骤中可以加入normal mouse IgG，如无normal IgG，可以加入其它不影响后续检测的其它mouse IgG类型的抗体。通过和normal IgG和Protein A+G Agarose的孵育，可以充分降低非特异性的结合，降低背景。 c. 免疫沉淀： (a) 加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗，4ºC缓慢摇动过夜。 (b) 再加入20微升充分重悬的Protein A+G Agarose，4ºC缓慢摇动1-3个小时(为方便后续的洗涤操作，可以把加入充分重悬的Protein A+G Agarose的量调整为40微升)。 (c) 2500rpm(约1000g)离心5分钟，或瞬时高速离心，小心吸除上清，注意宁可留下少量上清也不能吸掉Protein A+G Agarose。 (d) 用准备蛋白样品时的裂解液或PBS洗涤沉淀5次，裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升。洗涤时离心条件和吸除上清的要求同上面的步骤(c)。 (e) 完成最后一次洗涤后，去除上清，加入20-40微升1X SDSPAGE电泳上样缓冲液Vortex重悬沉淀，瞬时高速离心把样品离心至管底。 (f) 100ºC或沸水浴处理3-5分钟，取部分或全部样品用于SDSPAGE电泳，暂时不用的样品可以-20ºC保存。 2. 免疫共沉淀： 参考免疫沉淀的方法进行，但免疫共沉淀(Co-IP)通常必须使用未经冻存的新鲜蛋白样品。普通的免疫沉淀虽然可以使用冻存的蛋白样品，但也宜用新鲜的蛋白样品为佳。 3. 抗体纯化： a. 准备工作： (a) 用0.45微米或0.2微米孔径的滤膜过滤所用的溶液。 (b) 所有的溶液必须用超声等方法脱气(degas)。 (c) 选择适当的纯化柱，用适当量的Protein A+G Agarose装填纯化柱。 (d) 用10-20倍柱体积的TBS洗涤并平衡纯化柱，流速可以用恒流泵控制为1ml/min (1ml预装柱)。如无恒流泵，也可以完全依靠重力洗涤并平衡纯化柱。 b. 抗体纯化： (a) 把含有待纯化的抗体上样到纯化柱。 (b) 待纯化的抗体过柱后，用10-20倍柱体积的TBS洗涤，以去除未结合和非特异性结合的蛋白。洗涤是否完全可以通过测定280nm的吸光度进行确定。 (c) 洗涤完后，用10ml 50mM glycine，pH2.7作为洗脱液，洗脱结合的抗体。某些抗体和Protein A+G的结合能力很强，在pH2.7时洗脱效果不太理想，可以使用 50mM glycine，pH1.9作为洗脱液。分管收集洗脱下的抗体，根据蛋白浓度或后续的检测效果确定洗脱峰在哪几个收集管中。 c. 纯化柱的再生： (a) 用10-20倍柱体积的TBS洗涤纯化柱，使纯化柱达到中性的pH。 (b) 用TBS来保存再生的纯化柱。
注意： 1.请勿冷冻保存本产品。 2.Protein A+G Agarose使用前一定要充分重悬，即充分颠倒若干次使混合均匀。 3.本产品含有微量防腐剂，不会影响常规的免疫沉淀和抗体纯化。但如果后续涉及酶活性测定，使用本产品前宜先用TBS等适当溶液洗涤Protein A+G agarose beads三次，以充分消除防腐剂可能产生的干扰。 4.从蛋白样品收集开始，所有步骤中蛋白样品都必须在4ºC或冰上操作。 | 
